Бактерий научили действовать как команда

Ученые из России создали инновационный механизм регуляции активности генов у микроорганизмов, дающий возможность управлять синтезом нужных белков для каждого микроорганизма в отдельности. Разработка групп клеток с запрограммированной выработкой белковых веществ открывает новые возможности в сфере синтетической биологии и промышленных ферментационных процессов. По данным пресс-службы МФТИ, ключевую роль в этой системе играют гены бактерии Aliivibrio logei, способной жить при низких температурах.

Кроме того, новый инструмент позволяет преодолеть ещё одну острую задачу современной биотехнологии, эгоизм клеток, при котором в одинаковой среде одни микроорганизмы активно синтезируют требуемый белок, тогда как другие остаются пассивными. Сейчас микробиологи повсеместно используют бактериальные клетки в роли биореакторов, то есть как системы для промышленного получения нужных веществ. С их помощью производят белки, нуклеиновые кислоты, различные органические соединения и низкомолекулярные вещества.

«Чтобы заставить бактерию синтезировать нужный белок, инженеры проводят генную модификацию: доставляют в клетки инструкции в виде молекул ДНК-векторов с встроенными в них генами, позволяющие регулировать процесс синтеза необходимых белков. Но зачастую разные задачи требуют применения разных ДНК-векторов (инструкций) и нет универсальной, подходящей для всех задач. В итоге чтобы получить требуемые результаты, необходимо перебирать варианты инструкций. Это трудоемкая процедура»,— обьяснил Сергей Баженов, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной генетики МФТИ. 

В таких условиях разные ДНК‑векторы обеспечивают неодинаковую степень контроля над синтезом целевого белка и поддержания его на заданном уровне. После внесения индуктора (вещества, являющегося сигналом к началу синтеза), запускается процесс выработки белка, в то время как остальные клетки остаются в стороне от этого процесса. Это приводит к снижению суммарного выхода целевого продукта, росту метаболической нагрузки на активно работающие клетки и создаёт существенные технологические сложности при масштабировании процесса. На протяжении длительного времени исследователи искали способ добиться синхронной работы бактериальной популяции, и искомое решение было найдено в морских экосистемах.

«Мы не первый год изучаем поведение клеток бактерий. Пару лет назад наш коллектив разработал генетическую конструкцию, которая обладала уникальными свойствами, позволяющими выращивать культуру клеток при 37°С, не запуская при этом синтез нужных нам белков. Это обеспечивало возможность культуре быстро расти, не расходуя ресурсы на преждевременную работу. В итоге мы максимально быстро расширяли производственную мощность, а затем понижали температуру до 22–24°С, и клетки начинали обмениваться друг с другом малыми молекулами аутоиндуктора — информацией о том, насколько их много, и при достижении кворума начинали дружно вырабатывать целевой белок. Но бывают задачи, когда нужен не сам белок, а некий продукт, который этот белок производит. Тогда в какой-то момент нам необходимо остановить производство. Белок перестает синтезироваться и начинает уже сам производить другие вещества. Или, например, мы исследуем функцию этого белка и задаемся целью создать фиксированное количество белка в каждой клетке. Мы охладили нашу популяцию бактерий, они почувствовали, что их много, в ответ начался синтез белка, который мы в нужный момент остановили уже за счет повышения температуры снова до 37°. В итоге за счет одного нашего вектора мы могли выполнять целый ряд задач. При этом раньше мы эти возможности показывали на уровне целой популяции. В новой же работе мы опустились на уровень отдельных клеток»,— рассказал Сергей Баженов. 

Инженеры встроили в генную конструкцию фрагменты бактерии Aliivibrio logei. Так бактерии научились обмениваться информацией через химические сигналы. Этот механизм называют кворум‑сенсингом. Он позволяет бактериям согласовывать активность по численности сообщества и одновременно запускать нужные гены. Например, они могут начать светиться или формировать плёнку. Важную роль играют рецептор LuxR и фермент LuxI. Фермент вырабатывает сигнальные вещества. Вещество 3OxoC6‑HSL проникает в клетку и связывается с LuxR. Это приводит к активации нужных генов. Механизм ценят за автономность. В обычных системах сигнал приходится доставлять в клетку. Здесь вещество проникает само. Поэтому сигнал распределяется по популяции равномернее.

«Новая генетическая конструкция позволила нам наблюдать, как происходит активация синтеза и его остановка на уровне каждой отдельной клетки. Наблюдения этих процессов на всей популяции давали нам картину «средней температуры по больнице», и мы не знали, достигается ли промежуточное содержание целевого белка за счет частичной вовлеченности бактерий в процесс синтеза или же за счет регуляции активности каждой клетки в популяции. Наша векторная система позволила не только запустить и остановить синтез, но еще и отрегулировать интенсивность процесса. При этом в новой работе мы показали, что запуск синтеза и регуляция его интенсивности происходят во всех клетках одинаково, то есть не происходит разделения культуры на “трудяг” и “лентяев”. Представим эксперимент в трех пробирках. В контрольной мы не снижаем температуру и в итоге не получим белок, в другой снизим температуру и дадим бактериям расти и самостоятельно запустить синтез при достижении кворума, получив при этом предельное количество белка. А третья пробирка имеет переменный режим: мы ее ненадолго охлаждаем, искусственно запускаем синтез целевого белка, добавив индуктор, а потом останавливаем синтез, поднимая температуру вновь. И таким образом мы получаем любое промежуточное значение от полного отсутствия до максимального значения, варьируя условия культивирования: время и интенсивность индукции. И это промежуточное значение будет достигаться не за счет того, что часть клеток активировалась, а часть нет, а за счет того, что каждая клетка активировалась в меру того, как мы хотели»,— подчеркнул Сергей Баженов. 

Центральным моментом разработки плана исследования стало изучение функции контура положительной обратной связи, а именно, скажется ли возможность клеток производить молекулы индуктора на согласованность и единообразие выработки нужного белка. В качестве объекта для тестирования выбрали быстро созревающий флуоресцентный белок sfGFP, что дало возможность при помощи цитометрии измерить его концентрацию в индивидуальной клетке.

Спустя 30 минут после охлаждения и запуска процесса распределение флуоресцентного сигнала было широким, а при наивысшей концентрации аутоиндуктора проявлялась слабая бимодальность, что свидетельствовало о неспособности части популяции быстро откликнуться на стимул. Тем не менее, уже по истечении трех часов индукции ситуация полностью изменилась. Гистограммы флуоресценции стали узкими, монотонными и строго разделенными в зависимости от уровня концентрации аутоиндуктора. Таким образом, промежуточные значения экспрессии формируются не благодаря смешению активных и неактивных клеток, а посредством однородного изменения интенсивности синтеза в каждой ячейке популяции.

Учёные сравнили две конструкции плазмид. Оказалось, что ген luxI почти не влияет на стабильность выработки нужных веществ в заданных условиях. Но при этом фермент LuxI запускает особый процесс (аутоиндукцию). Из‑за него свечение клеток в эксперименте постепенно становилось ярче. Когда клеток становится больше, вырабатываемое ими вещество накапливается и включает активную выработку нужных белков. В промышленном производстве это удобно, потому что синтез белка начинается сам, как только плотность клеток достигает нужного уровня. В штамме, где ген luxI удалили, свечения без внешнего воздействия почти не было. Оно оставалось на минимальном уровне. Это позволило точно управлять выработкой белка, просто добавляя вещество‑индуктор в разной концентрации.

При температуре 37 °C производство белка почти останавливается. Запустить его можно только при более низкой температуре - 22 °C. Учёные использовали эту особенность, чтобы определять промежуточный уровень белка. Меняя температуру, можно удерживать нужный уровень выработки. Это важно для исследований, где нужен точный контроль концентрации белка - например, при изучении опасных или токсичных белков.

Она позволяет глубоко проникнуть в механизмы, посредством которых популяция клеток обрабатывает и распределяет сигнальную информацию. Разработанный подход служит моделью для исследования этих явлений в контролируемой среде и выступает действенным инструментом в области бактериальной биотехнологии. Данный этап знаменует собой существенный прогресс на пути к технологиям точной настройки генной экспрессии.

Статья опубликована в журнале Biotech. Исследование поддержано Министерством науки и высшего образования РФ и Российским научным фондом .